Der Geek-Atlas (German Edition)

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    Shotgun Sequencing
    Die Verarbeitung eines Genoms von einer Größe, wie sie beim Menschen gegeben ist, erfordert eine Methode, die für die Arbeit
     mit Milliarden von Basenpaaren geeignet ist. Die Methoden, die für Organismen mit kurzen Genomen (wie es bei dem bereits genannten
     bovinen Virus der Fall ist) verwendet wurden, waren dieser Aufgabe nicht gewachsen. Gegen Ende der 1970er kam die Idee auf,
     lange DNA-Stränge in kürzere Fragmente aufzuteilen und diese dann zu sequenzieren. Bei dieser Technik wurden Computer eingesetzt,
     um die Original-DNA später aus den Fragmenten wiederherzustellen. Das Verfahren wurde als Shotgun Sequencing bekannt.
    Beim Shotgun Sequencing wird ein langer DNA-Strang mittels eines Geräts mit dem Namen HydroShear zerlegt. Die DNA wird verdünnt
     und durch kleine Löcher in einen Rubin gedrückt. Während die DNA durch diese Löcher fließt, wird sie durch den Flüssigkeitsdruck
     gestreckt und bricht an zufälligen Stellen auseinander. Leider bringt dieser Prozess die DNA-Fragmente durcheinander und es
     ist recht schwierig, sie wieder in der richtigen Reihenfolge zusammenzusetzen.
    Die resultierenden DNA-Fragmente werden zunächst in ein Plasmid (ein Stück DNA, das von einem Bakterium angenommen und in
     dessen eigene DNA eingebunden werden kann) eingefügt. Dieses speziell präparierte Plasmid pUC18 enthält zwei zusätzliche,
     sehr nützliche DNA-Anteile – einer bietet antibiotische Resistenz und der andere färbt die Bakterien, die es aufnehmen, blau.
    Die so präparierten Plasmide werden dann in einer Lösung mit E. coli-Bakterien gemischt. Die Bakterien werden (elektrisch)
     angeregt, das Plasmid und die drei DNA-Teile aufzunehmen. Dann werden Sie mit einem Antibiotikum behandelt, um alle Bakterien
     abzutöten, die sich das DNA-Plasmid nicht einverleibt haben. Übrig bleibt eine Population speziell präparierter E. coli-Bakterien,
     die sich Reproduzieren können und so die ursprünglichen DNA-Fragmente replizieren.
    Nun dürfen die E. coli-Bakterien wachsen und Kolonien bilden. Einige Kolonien färben sich blau (weil sie das Plasmid angenommen
     und eingebunden haben), während die anderen weiß bleiben (weil sie das Antibiotikum überlebt haben, obwohl sie das Plasmid
     nicht korrekt eingebunden haben). Ein mit einer speziellem Kamera ausgestatteter Roboter pickt sich die blauen Bakterien heraus.
     Deren Anzahl kann dann weiter wachsen, bis Milliarden von E. coli-Bakterien vorhanden sind, alle mit Kopien der zu sequenzierenden
     DNA-Fragmente.
    Ein weiterer Roboter platziert die Bakterien in einer Maschine, in der sie auf 95°C erhitzt werden. Dadurch brechen die Bakterien
     auf und die Plasmide mit den DNA-Kopien werden freigeben. Anschließend werden die DNA-Basenpaare in weiteren chemischen Reaktionen
     mit fluoreszierenden Farben eingefärbt (die entsprechenden Arbeitsgänge werden dabei größtenteils ebenfalls wieder von Robotern
     durchgeführt). Jedes Basenpaar erhält eine andere Farbe, sodass die jeweilige Basenpaar-Sequenz anhand der Farben identifizierbar
     ist.
    Die DNA wird dann durch eine Kapillare in eine Maschine geleitet, die die eingefärbten Basenpaare mithilfe eines Lasers »lesen«
     kann, und so die DNA-Sequenz des DNA-Fragments festhält. Doch bei diesem Vorgang können nur die ersten etwa 1000 Basenpaare
     jedes Fragments verarbeitet werden. Aus diesem Grund ist der ganze Prozess so konzipiert, dass viele Kopien der DNA in viele
     verschiedene Fragmente aufgeteilt werden, die dann partiell sequenziert werden. Da diese Fragmente zufällige DNA-Segmente
     sind, liegt die gleiche DNA-Sequenz in vielen verschiedenen Fragmenten vor. Mithilfe dieser überlappenden Fragmente kann ein
     Computer die passenden Sequenzen zusammenfügen, um dann ein vollständiges Bild der DNA zu entwickeln.
    Mit einer speziellen Software (siehe Abbildung 88.1 ) werden dann die aus den Fragmenten ermittelten Sequenzen untersucht. Anschließend wird diesen ein Qualitätsmaß zugewiesen
     (um festzulegen, wie verlässlich die Identifikation des Basenpaares ist). Eine andere Software, die an der Universität von
     Washington konzipiert wurde, fügt dann die passenden Fragmente wieder zusammen.
    Abbildung 88.1 Alignment von DNA-Fragmenten durch einen Computer; zur Verfügung gestellt von David Gordon, Howard Hughes